细胞冻存是一种用于在低温环境中保存细胞的方法，其目标是确保细胞在长时间内保持活性与功能。这一技术对于长期保存细胞系、保证实验的重复性、建立基因库，以及提供细胞治疗的储备具有重要意义。通过细胞冻存，可以有效降低细胞传代过程中可能出现的遗传变异，并减少因污染、环境改变或操作错误而导致的细胞损失。最佳的冻存时机是在细胞处于最优生长阶段时。

在细胞冻存过程中，冷冻保护剂是关键成分，常见的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用是降低溶液的冰点，从而减少冰晶的生成，保护细胞免受机制损伤。DMSO适用于大多数细胞类型，但需注意某些细胞对此敏感，此时可选用甘油作为替代。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上注明日期、实验人员姓名、细胞编号、传代数以及细胞类型等信息。

2. 对于贴壁细胞，首先去除培养基，然后用PBS清洗，加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，放入37°C培养箱中孵育约2分钟。在此之后，添加等量的培养基终止消化，用移液枪轻轻地吹打细胞，并将其转移至50 mL的Falcon管中。

3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积的细胞转移到50 mL的Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计算细胞数量，并确认活力至少为75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟。

6. 准备冷冻培养基（详见表1）。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

• 在含有FBS的培养基中：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
• 在无血清培养基中：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
• 需要甘油的细胞：90%胎牛血清 + 10%甘油

使用前需均匀混合并加热至37°C。冷冻培养基中应含有必需的冷冻保护剂，以防止细胞膜和成分受损。

7. 去除上清液。

8. 加入冻存培养基以达到所需细胞密度，哺乳动物细胞的浓度通常为1×10⁶/mL。冻存液中的细胞在室温下放置时间不得超过10分钟。

9. 将1 mL样品分装于冷冻管中，盖好管盖。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，然后放入-80°C冰箱。外周添加适量异丙醇，以确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢冷冻过程（每分钟-1°C）有助于防止细胞内形成冰晶。

11. 大约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移至液氮中进行长期保存。冷冻细胞在液氮中可保存数年，理想情况下，不应在-80°C长期保存细胞（最多一周），应尽快转移至液氮中，以避免损害细胞活力。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中，直至约80%解冻（避免在室温下解冻）。此过程应在1分钟内完成。

2. 使用移液器将冷冻管中的内容物转移到含有约10 mL预热培养基的15 mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，并用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器中，并放入37°C培养箱中进行培养。

在细胞冻存与解冻过程中，特别值得关注的是选择合适的冷冻保护剂和操作方式，以确保细胞的活性和功能，尊龙凯时致力于提供优质的细胞冷冻保存解决方案，助力生物医疗研究的持续发展。