免疫沉淀实验是生物医学研究中用于探讨蛋白质相互作用及其表达状态的重要技术。根据具体实验需求，可以选择不同的免疫沉淀方法，主要分为磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。

    磁珠免疫沉淀法通过蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合来捕获目标蛋白。这一方法的优点在于操作简便、快速，且分离效率高，非常适合进行高通量筛选和自动化实验。利用磁性分离架，磁珠能实现快速分离，使实验步骤更加高效。此外，磁珠免疫沉淀法在蛋白质-蛋白质相互作用及信号传导研究中显示出了其不可替代的价值。

    相比之下，固定免疫沉淀法使用固定化抗体（通常是抗体偶联到珠子上）来捕获目标蛋白，主要用于蛋白质印迹法（Western Blot）分析前的样品准备。这种方法通常需要更长的孵育时间以形成免疫复合物，但其高特异性和灵敏度使其适合于定量分析目标蛋白的表达和修饰状态。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰及蛋白质稳定性方面尤为重要。

    在此，我们将详细描述固定免疫沉淀法的具体实验操作步骤。所需的溶液与试剂包括：

    (1) PBS缓冲液。
    (2) 1×细胞裂解缓冲液：20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、25 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml 亮抑酶肽。
    (3) 3× SDS样品缓冲液：187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C）、6% w/v SDS、30% 甘油、150 mM DTT、0.03% w/v 溴酚蓝。
    注：上述溶液均需使用超纯水制备。细胞裂解液在使用前应添加1 mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

    1. 吸干培养基。根据实验目的，添加含调节因子的新的培养基，对细胞处理一段时间。
    2. 去除培养基，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次。
    3. 去除PBS，每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml预冷的1×细胞裂解缓冲液及1 mM PMSF。
    4. 置于冰上孵育5分钟。
    5. 从板上轻轻刮下细胞，转移至微量离心管，并置于冰上。
    6. 在冰上对样品进行超声处理四次，每次5秒。
    7. 在4°C下微量离心10分钟，将上清液转移至新的试管中。
    8. 如不进行后续实验，应将裂解物保存在-80°C。

2. 免疫沉淀法

    1. 取200 µl细胞裂解物，加入10 µl固定抗体，轻轻摇动并在4°C下孵育过夜。
    2. 在4°C条件下微量离心30秒。
    3. 用500 µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗，离心去除上清，共清洗五次。洗涤时保持样品于冰上。
    4. 使用20 µl 3× SDS样品缓冲液重悬沉淀物，涡旋混匀后微量离心30秒。
    5. 加热样品至95-100°C，并持续加热2-5分钟。
    6. 取15-30 µl样品上样到SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质印迹实验（请参阅相关实验步骤）。

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