尊龙凯时致力于生物医学领域的研究与开发,本文旨在介绍使用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的详细过程。
目的
学习并掌握使用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的技术。
原理
大肠杆菌在0℃的CaCl2低渗溶液中胀大为球形,导致部分膜蛋白的丧失,从而使细胞具备更高的能力吸收外源DNA。
器材
所需器材包括旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、50ml微量离心管、15ml微量离心管、双面微量离心管架、台式冷冻离心机、制冰机、恒温摇床、分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、摇菌试管以及三角烧瓶和接种环。
试剂
实验中使用的试剂包括EcoliXL1-Blue菌株、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液及无菌ddH2O。
实验准备
15ml的离心管需装入铝制饭盒进行灭菌,移液器吸头需放入相应的吸头盒进行灭菌。平板培养基、LB培养基、冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液及无菌ddH2O也需事先灭菌。
操作步骤
(1)在超净工作台中,取一无菌摇菌试管,加入2ml不含抗生素的LB培养基。
(2)取出冰冻的XL1-Blue菌种,放置于冰上。接种环烧红后插入冻结的菌株中,然后接入含2ml LB培养基的试管,安放于37℃的摇床中培养过夜。
(3)将0.5ml的菌液转接至含50ml LB培养基的三角烧瓶中,在37℃、250rpm摇床上培养2~3小时,测定OD600值为0.375(应小于0.4~0.6,细胞数应小于10^8/ml,这是关键参数!)。除离心外的操作需在超净工作台中进行。
(4)将培养液分装入预冷的15ml无菌聚丙烯离心管中,置于冰上静置10分钟,随后在4℃下以5000rpm离心10分钟。
(5)倒置离心管,弃去上清液,加入1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液,立即在涡旋混合器上混匀,并在冰中静置30分钟。
(6)再次在4℃、5000rpm下离心10分钟,弃去上清液后,用1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞,放入冰中静置30分钟。
(7)继续在4℃、5000rpm下离心10分钟,弃去上清液后,用200μl的冰冷0.1mol/L CaCl2溶液悬浮,并在超净工作台中按每管100μl分装至15ml离心管中。这些细胞可以直接用于转化实验,或迅速放入-80℃的超低温冰柜中保存(可存放数月)。
(8)在被细菌污染的表面喷洒70%乙醇,并用干净的布擦拭干净,以确保操作环境的无菌性。
通过以上步骤,您可以有效地制备大肠杆菌感受态细胞,为后续的遗传工程实验奠定基础。在生物医学研究中,采用尊龙凯时提供的技术与设备,将有助于提高实验的成功率。