尊龙凯时致力于生物医学领域的研究与开发，本文旨在介绍使用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的详细过程。

目的

学习并掌握使用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的技术。

原理

大肠杆菌在0℃的CaCl2低渗溶液中胀大为球形，导致部分膜蛋白的丧失，从而使细胞具备更高的能力吸收外源DNA。

器材

所需器材包括旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、50ml微量离心管、15ml微量离心管、双面微量离心管架、台式冷冻离心机、制冰机、恒温摇床、分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、摇菌试管以及三角烧瓶和接种环。

试剂

实验中使用的试剂包括EcoliXL1-Blue菌株、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液及无菌ddH2O。

实验准备

15ml的离心管需装入铝制饭盒进行灭菌，移液器吸头需放入相应的吸头盒进行灭菌。平板培养基、LB培养基、冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液及无菌ddH2O也需事先灭菌。

操作步骤

（1）在超净工作台中，取一无菌摇菌试管，加入2ml不含抗生素的LB培养基。

（2）取出冰冻的XL1-Blue菌种，放置于冰上。接种环烧红后插入冻结的菌株中，然后接入含2ml LB培养基的试管，安放于37℃的摇床中培养过夜。

（3）将0.5ml的菌液转接至含50ml LB培养基的三角烧瓶中，在37℃、250rpm摇床上培养2~3小时，测定OD600值为0.375（应小于0.4~0.6，细胞数应小于10^8/ml，这是关键参数！）。除离心外的操作需在超净工作台中进行。

（4）将培养液分装入预冷的15ml无菌聚丙烯离心管中，置于冰上静置10分钟，随后在4℃下以5000rpm离心10分钟。

（5）倒置离心管，弃去上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，并在冰中静置30分钟。

（6）再次在4℃、5000rpm下离心10分钟，弃去上清液后，用1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，放入冰中静置30分钟。

（7）继续在4℃、5000rpm下离心10分钟，弃去上清液后，用200μl的冰冷0.1mol/L CaCl2溶液悬浮，并在超净工作台中按每管100μl分装至15ml离心管中。这些细胞可以直接用于转化实验，或迅速放入-80℃的超低温冰柜中保存（可存放数月）。

（8）在被细菌污染的表面喷洒70%乙醇，并用干净的布擦拭干净，以确保操作环境的无菌性。

通过以上步骤，您可以有效地制备大肠杆菌感受态细胞，为后续的遗传工程实验奠定基础。在生物医学研究中，采用尊龙凯时提供的技术与设备，将有助于提高实验的成功率。